Интрацитоплазмено спермално инжектиране (ICSI) представлява инжектиране на един сперматозоид директно в цитоплазмата на яйцеклетката. Процедурата се извършва с помощта на т.нар инвертен микроскоп при увеличение 200-400 пъти, с размер на работната повърхност на пипетите 20 пъти (държаща пипета) и 60 пъти (инжекционна пипета) по-малка от диаметъра на човешки косъм.

При тази процедура, яйцеклетките се освобождават от заобикалящите ги кумулусни клетки с помощта на ензима хиалуронидаза. Следва обездвижване и захващане на подходящ сперматозоид чрез т.нар инжекционна (injection) пипета, фиксиране на яйцеклетката с т.нар. държаща (holding) пипета и инжектиране на сперматозоида в цитоплазмата на яйцеклетката.

Инжектираната със сперматозоид яйцеклетка се връща в инкубатора и 16-18 часа по-късно се разглежда за наличие на оплождане.

Показания за приложение на ICSI процедура:

• Oligozoospermia (по-малко от 20 милиона/мл);
• Asthenozoospermia (по-малко от 30% подвижни сперматозоиди);
• Teratozoospermia (по-малко от 5% нормални форми по стриктните критерии на Kruger);
• Диагностицирана лоша преживяемост на сперматозоидите;
• Пациенти, при които липсва оплождане в предходен IVF цикъл;
• Пациенти, при който е налице неуспех след няколкократни IVF цикъла.

• MESA (Аспирация на сперматозоиди от епидидимиса);
• TESA (Аспирация на сперматозоиди от тестиса);
• TESE (Екстрация на сперматозоиди от тестисa).

Преимплантационна генетична диагностика
Преимплантационната генетична диагностика се състои в изолиране на един от бластомерите (клетките) на развиващия се ембрион, който се подлага на генетичен анализ, с цел откриване на генетични отклонения и трансфериране (връщане) в матката на ембрион с нормален генетичен код.

Методът се прилага при случаи с два или повече спонтанни аборта, напреднала възраст на жената, многократно неуспешни IVF процедури, хромозомни транслокации, доказана абнормална тестикуларна мейоза при мъжа. Преимплантационната генетична диагностика повишава процента на забременяване, намалява риска от многоплодни бременности, поради малкия брой трансферирани ембриони.

Изолиране на бластомер от ембриона

Преимплантационната генетична диагностика (PGD) е метод за ранно тестуване на ооцити или ембриони, с цел предотвратяване раждането на деца с генетични заболявания. Този метод съчетава асистираните репродуктивни технологии, ембриологията и генетиката.
PGD е най-ранното налично пренатално изследване за пациентите, което се прилага при осъществяването на IVF/ICSI процедури, като диагностицирането на ембрионите с неправилен генетичен код се извършва преди връщането им в маточното тяло. За ембриотрансфер се селектират само ембриони с правилен генетичен код. Така при реализиране на бременност са налице сигурни данни, че рискът от вродени генетични заболявания в развиващия се фетус е чувствително намален.
Преимплантационната генетична диагностика може да се прилага с цел повишаване индекса на имплантация на ембрионите и респективно увеличаване на шанса за бременност и раждане на здраво дете. Използва се за скрининг на яйцеклетки, сперматозоиди и ембриони за хромозомни аномалии и за отделни генни увреждания както и за установяване на пола.
Основните показания за преимплантационна генетична диагностика са:

• възраст на майката над 34 години;
• възраст на родителите над 39 години;
• носителство на хромозомни промени- транслокации, инверсии или други хромозомни или генни аномалии;
• два или повече спонтанни аборта;
• две или повече неуспешни IVF процедури;
• мъже с абнормален анализ за сперматозоидна пенетрация и хроматинова структура.

PGD представлява поредица от процедури включващи:
1) ембрионална биопсия, която най-често се извършва на 3-ти ден от аспирирането на ооцитите, когато ембрионът е на 6- или 8-клетъчен стадий.

8-клетъчен ембрион

пробиване на zona pellucida

аспириране на един бластомер

клетка, аспирирана от ембриона, готова за анализ

• детерминиране на генетичната информация чрез флуоресцентна in situ хибридизация (FISH) - за анализиране на цели хромозоми и/или полимеразна верижна реакция (PCR) – за изследване на специфични гени.

Всеки нормален ембрион съдържа 46 хромозоми, 23 от които произхождат от яйцеклетката, а останалите 23 – от сперматозоида. По този начин ембрионът, съдържащ 46 нормални хромозоми се нарича еуплоиден ембрион. Хромозомите се състоят от гени, които действат като химични съобщения, уведомяващи клетката как да расте и да функционира в различните процеси, които се осъществяват в човешкото тяло. Съществуват повече от 30 000 различни гени, съставени от ДНК, подредена в специфична последователност, съдържаща „кода“ за всеки отделен ген и неговата функция. Разрушаването на нормалната структура (код), както и нарушенията в броя на гените или хромозомите може да има тежки последици.
Анеуплоидията е най-разпространената хромозомна аномалия и представлява наличие на допълнителна хромозома (тризомия) или липса на хромозома (монозомия). Когато има допълнителни или липсващи хромозоми, вероятността за имплантация намалява, увеличава се процентът на спонтанните аборти. Когато са засегнати хромозоми 13, 18, 21, Х или У може да се осъществи имплантация и бременността да продължи да се развива, в резултат на което да се роди дете с хромозомно заболяване. Най-разпространената тризомия е Тризомия 21 или Синдромът на Даун. Останалите отклонения включват Синдром на Патау (тризомия 13), Синдром на Едуард (тризомия 18), Синдром на Клайнфелтер (47 ХХУ), Синдром на Търнър (45 Х, липсваща полова хромозома). При спонтанни аборти най-често се установяват тризомии 15, 16, 21 и 22. Най-разпространените анеуплоидии при ембриони на 3 дни са 15, 16, 17, 21 и 22.

Нормален женски кариотип – две червено оцветени хромозоми 13, две синьо оцветени хромозоми 18, две зелено оцветени хромозоми 21 и две Х хромозоми (розово).

Нормален мъжки кариотип – две червено оцветени хромозоми 13, две синьо оцветени хромозоми 18, две зелено оцветени хромозоми 21 и една Х хромозома, оцветена в розово и една оцветена в жълто У хромозома.

Кариотип с тризомия Х (47,ХХХ) - „свръхжени“ - притежават висок ръст, недоразвити полови органи, ограничена плодовитост и умствена изостаналост. Наблюдават се
две червено оцветени хромозоми 13, две синьо оцветени хромозоми 18, две зелено оцветени хромозоми 21 и три Х хромозоми (розово).

Кариотип ХХУ – Синдром на Клайнфелтер - две червено оцветени хромозоми 13, две синьо оцветени хромозоми 18, две зелено оцветени хромозоми 21, две Х хромозоми, оцветени в розово и една жълто оцветена У хромозома.

Кариотип с тризомия 13 – три червено оцветени хромозоми 13, две синьо оцветени хромозоми 18, две зелено оцветени хромозоми 21, една Х хромозома, оцветена в розово и една жълто оцветена У хромозома.

Кариотип с тризомия 18 - две червено оцветени хромозоми 13, три синьо оцветени хромозоми 18, две зелено оцветени хромозоми 21, една Х хромозома, оцветена в розово и една жълто оцветена У хромозома.

Кариотип с тризомия 21 – синдром на Даун – две червено оцветени хромозоми 13, две синьо оцветени хромозоми 18, три зелено оцветени хромозоми 21, една Х хромозома, оцветена в розово и една жълто оцветена У хромозома.

Вероятността за анеуплодия се увеличава с напредване възрастта на майката. Тъй като жените се раждат със своя резерв от яйцеклетки за цял живот, се счита, че яйцеклетките на жените в напреднала възраст е по-вероятно да допуснат грешки при разделянето на техните хромозоми, в резултат на което се повишава процентът на яйцеклетките с липсваща или допълнителна хромозома. Изследванията показват, че повече от 20% от ембрионите на жени с възраст 35-39 години и 40-60% от ембрионите на жени на 40 и повече години са с анеуплоидии. Макар, че PGD за анеуплоидия значително намалява риска от раждане на дете засегнато от тризомия или монозомия, засега не е възможно да бъдат изследвани всички хромозоми. Основно се изследват: 13, 15, 16, 17, 18, 21, 22, Х и У хромозомите. Точността на PGD метода за диагностициране на анеуплоидия е повече от 90%.
PGD може също да се използва за установяване на транслокации - промeни в структурата на хромозомите. При пациенти с „балансирани” транслокации обикновено не се наблюдават промени, тъй като няма излишен или липсващ хромозомен материал и нарушението обикновено не разстройва генната функция. Типично за тези пациенти е, че те нямат медицински проблеми, въпреки че някои от тях са с намалена фертилност. „Небалансирана” транслокация е тази, при която има излишен или липсващ хромозомен материал. Вероятността за имплантиране на ембрион с небалансирана транслокация е малка, по-голяма е вероятността за аборт, но ако настъпи бременност – тя може да доведе до раждане на живо дете, което вероятно ще има физични или умствени проблеми. Реципрочните транслокации засягат около 1 на 625 човека. Този вид транслокация означава нарушение в две различни хромозоми, допускайки да бъдат разменени участъци между тях. Около 1 на 900 човека има Робертсонова транслокация, включваща хромозоми 13, 14, 15, 21 или 22. Тези хромозоми имат по-големи долни половини, които могат да се слеят една с друга. Рискът от повтарящи се спонтанни аборти или раждане на дете с малформации се влияе от включената хромозома(и) и размера на разменения фрагмент.
Чрез прилагането на PGD е възможно установяването на много единични генни дефекти. Това са заболявания, които са причинени от унаследяването на единичен дефектен ген. Има две категории единични генни дефекти:

• рецесивни – тези, при които за да се прояви заболяването са необходими две дефектни копия от този ген, по едно от всеки родител
• доминантни – тези, при които за да се прояви заболяването е необходимо само едно копие от дефектния ген

Препоръчва се предварителен скрининг за някои от най-разпространените единични генни дефекти като кистозна фиброза (CF) и Tay Sachs заболяване в рисковите популации.
Предимствата на преимплатационната генетична диагностика са:

• селекция и ембриотрансфер на тези ембриони, при които липсват сигурни данни за хромозомен абнормалитет;
• редукция на спонтанните аборти;
• редукция на многоплодните бременности;
• повишаване степента на имплантация на ембрионите;
• повишаване на процента на родени здрави деца.

Рискът при PGD включва:

• увреждане на ембрионите (< 1%)
• пропуск на диагностициране (< 10%)
• грешка при определяне на абнормален ембрион в нормален (< 3%)
• грешка при определяне на нормален ембрион в абнормален (< 10%)
• липса на ембриотрансфер при установяване на 100% абнормални ембриони (до 20%).

При естественото забременяване, излюпването на ембриона включва спонтанно разрушаване на мембраната, която обвива яйцеклетката - зона пелуцида. По този начин, ембрионът се освобождава за имплантация в матката. При някои случаи, зоната е абнормално дебела и не позволява излюпване на ембриона. Счита се, че липсата на имплантация на ембриона поне отчасти се дължи на невъзможността за разкъсване на зона пелуцида. Това означава, че ембриона не може да се имплантира в матката. Проблемът най-често е характерен за по-възрастни жени, въпреки че може да се наблюдава при всяка една възрастова група.

Асистираното излюпване на ембриона е микроманипулационен метод, който най-често се прилага на ембриони на стадий от 6 до 8 клетки непосредствено преди трансфера. Предполага се, че отворът, създаден в зоната подпомага излюпването и ранното взаимодействие между ембриона и ендометриума по време на най-критичния ранен етап.

Рисковете на процедурата са същите както при конвенционалната IVF процедура. Въпреки това съществува малък риск от увреждане на ембриона.

Препоръчва се при жени след 38 годишна възраст, пациентки с намален яйчников резерв, ендометриоза и при лошо качество на ембрионите.

“Излюпен” ембрион

Генетични изследвания при мъже с инфертилитет

Към стандартните тестове за оценка на инфертилитета при мъжа, могат да се приложат и тестове за диагностициране на генетични отклонения, които да са причина за безплодие.

Кои термини трябва да знаем, за да разберем генетичните проблеми при мъжа?
Соматични клетки: всички клетки на човешкото тяло, с изключение на сперматозоидите и яйцеклетките. Соматичните клетки съдържат 46 хромозоми.
Герминативни клетки: яйцеклетки и сперматозоиди. Тези клетки съдържат 23 хромозоми – половината от хромозомите на соматичните клетки.
Полови хромозоми: хромозомите Х и У. Те се намират както в соматичните така и в герминативните клетки. При соматичните клетки се установяват две полови хромозоми (ХХ при жената и ХУ - при мъжа), докато при герминативните клетки са налице по една Х или У хромозоми.
Автозоми: неполовите хромозоми в клетките.
Анеуплоид: клетки с абнормален брой хромозоми.
Мейоза: Процес на делене в герминативните клетки, характеризиращ се с генетична рекомбинация и редукция на броя на хромозомите от 46 на 23. Тези процеси се осъществяват в яйчника и тестиса.
Човешките соматични клетки съдържат 46 хромозоми: 22 двойки автозоми (хромозоми от 1 до 22) и две полови хромозоми, т.нар. диплоиден набор от хромозоми. Така жените имат кариотип 46, ХХ, а мъжете - 46, ХУ.

Как се установяват заболявания свързани с хрозомни отклонения?
Чрез определяне на кариотип.

Кога се препоръчва определяне на кариотип?
Определяне на кариотип се извършва при пациенти с безплодие. Индикациите за определяне на кариотип са:

• Азооспермия;
• Тежка олигозооспермия (с или без астено- и/или тератозооспермия);
• Нормозооспермия с данни за последващи спонтанни аборти;
• Пациенти, при които са прилагани без успех техники за АRT чрез ICSI процедура.

Необходими ли са последващи изследвания, ако кариотипът е нормален?
При мъже с нормален кариотип е възможно да се установят проблеми в процеса на мейозата (неразделяне на хомоложни хромозоми), което да причини образуването на анеуплоидни сперматозоиди. В тези случаи при оплождане на яйцеклетките се образуват нежизнени анеуплоидни ембриони.

Как генетичните и хромозомните отклонения могат да предзвикат безплодие?
Налице са три основни механизма, при които тези отклонения могат да предизвикат безплодие:

• отклонения в сперматогенезата;
• нарушения в транспорта на сперматозоидите;
• производство на сперматозоиди с хромозомни аномалии (анеуплоидни сперматозоиди).

Какви генетични или хромозомни аномалии са свързани с безплодието?
Най-често срещаните аномалии, свързани с безплодието са:

• Конституционален хромозомен абнормалитет;
• Абнормалитет ограничен в половите клетки;
• Микроделеци на У хромозомата;
• Мутации свързани с CFTR (трансмембранен регулатор на кистозна фиброза) гена.

Какво представлява конституционалния хромозомен абнормалитет?
Конституционалният хромозомен абнормалитет е свързан с отклонения в соматичните клетки. Те могат да са различни групи, но основните са:

• Бройни (промени в броя на хромозомите - липса и/или наличие на една или няколко групи от хромозоми).
• Структурни (промени в структурата на една или повече хромозми – могат да се дължат на промени в броя на гените в хромозомите или промени в местоположението на гените в хромозомите).

Понякога двата типа могат да се срещнат едновременно.

Колко често тези отклонения се срещат при пациенти със безплодие?
Случаите с конституционален хромозомен абнормалитет се срещат 13 пъти повече при пациенти с инфертилитет, в сравнение с основната популация. При тези пациенти наличието на конституционален хромозомен абнормалитет е обратно пропорционално на броя сперматозоиди. Следоватено при намален брой сперматозоиди в еякулата се увеличава риска за наличие на този тип аномалии.

Какво представляват микроделециите на У хромозомата?
Отклоненията при половите хромозоми са по-чести, в сравнение с отклоненията при автозомите. Хромозомата У е основния фактор определящ пола при мъжа и съдържа гени отговорни за сперматогенезата. Известно е, че при 0,5% от мъжете с безплодие се открива делеция (загуба на генетичен материал) на Yq хромозомата (дългото рамо на У хромозомата). Авторите установили това отклонение го определят кат AZF или Аzoospermia Factor, поради честото му диагностициране при мъже с азооспермия. Чрез PCR технология (полимеразна верижна реакция) са установени три групи отклонения в три различни локуса на У хромозомата: AZFa, AZFb и AZFc.

Кога се препоръчват изследвания за микроделеции на У хромозмата?
Микроделеции на дългото рамо на У хромозомата се установяват при 10% от мъжете с азооспермия и при 15% от пациентите с идиопатична тежка олигоастенозооспермия. В миналото, пациентите с тежка олигоастенозооспермия с делеции на У хромозомата бяха стерилни. Благодарение на съвременните АRT технологии като ICSI и TESA процедури, е възможно много от мъжете с У делеции да бъдат бащи. Пациентите с наличие на делеции едновременно и в трите региона - AZFa, AZFb и AZFc са с негативна прогноза, поради тоталното отсъствие на сперматозоиди в семенната течност и в тестиса.
Всички пациенти, носители на микроделеции на с успешни ICSI процедури пренасят микроделецията, свързана с инфертилни проблеми в тяхното поколение от мъжки пол.
За радост тези отклонения не се отнасят за децата от женски пол.

Какво представлява CFTR генна мутация?
Кистозната фиброза (Cystic Fibrosis - CF) e най-често разпространеното автозомно рецесивно заболяване, което се среща при едно на 2000 родени деца в кавказката популация. Около 4% са носители на дефектно копие на гена. Тъй като това е рецесивно заболяване, за да се прояви са необходими две копия от дефектния ген, по едно от всеки родител. Едно копие от дефектния ген прави човека „носител” на заболяването. Ако и двамата родители са носители - вероятността тяхното дете да е засегнато е 25%, да е носител - 50% и 25% е шансът детето да няма копие от дефектния ген. Повече от 95 % от мъжете носители на CF са инфертилни. Генът причиняващ CF е разположен на дългото рамо на 7 хромозома (q 31).

Кога се препоръчват изследвания за CFTR генна мутация?
Търсене на CFTR генна мутация се препоръчва при случаи с:

• Азооспермия ,причинена от вродена двустранна липса на vas deferens;
• Едностранна липса на vas deferens, с или без азооспермия;
• Обструктивна азооспермия.

При установяване на CFTR генна мутация при мъжа се препоръчва търсене на носителство на CFTR генна мутация и при майката. При наличие на такава, е налице висок риск от носителство на мутацията в ембрионите и клинично й проявяване като заболяване при роденото дете. При тези случаи се препоръчва използването на преимплантационна генетична диагностика, с цел установяване или отхвърляне на тази мутация в ембрионите.

Как могат да бъдат установени генетични отклонения в сперматозоидите?
През последните няколко години, с помощта на новите технологии, стана възможно да се извърши анализ на сперматозоидните хромозоми. Методът се нарича флуорисцентна ин ситу хибридизация (FISH).
FISH технологията може да се приложи при сперматозоиди, като се анализират 5 от 23 хромозоми (13, 18, 21, Х, У). Независимо от сравнително лесното приложение на тази технология, при нея се установява непълност на хромозомния анализ. По-обективен метод, който носи индиректна информация за хромозомите, е изследването на процеса мейоза в тестикуларната тъкан. Чрез тестикуларна бипопсия може да се установят отклонения в хромозомния набор по време на първото или второто мейотично делене.

Какво преставлява тестикуларната биопсия?
Тестикуларната биопсия представлява оперативна процедура, която се извършва под локална анестезия в здравни заведения за доболнична помощ. С помощта на малък разрез (около 1 см) се екстрахира късче от тестикуларната тъкан.

Кога се препоръчва изследване на мейозата в тестикуларната тъкан?
Проучвания определят, че между 4 и 8% от мъжете с фертилни проблеми имат нарушения в процеса мейоза в сперматогенезата. Случаите на отклонения нарастват до 18% при мъже с тежка олигоастенозооспермия. Според някои автори нарушение в мейозата се наблюдава при 20,4% мъже с тежка олигоастенозооспермия и в 18% при мъже с астенотератозооспермия. Интересен е факта, че нарушение в мейозата се наблюдава и при 45% от пациентите с нормозооспермия, но с анамнестични данни за поредица от спонтанни аборти и неуспешни IVF процедури.

Каква е възможността за лечение при установяване на абнормалитет в кариотипа или при изследване на мейозата?
За съжаление, при установяване на тези заболявания в пациентите не съществува лечение и прогнозата за фертилния им потенциал е лоша. Това обаче, не означава че мъже с тези заблявания не могат да образуват малък процент сперматозоиди с нормален хромозомен набор. За съжаление, все още не е открита технология за тяхното изолиране и успешното им прилагане в ART. Логично е тези пациенти с абнормален кариотип и отклонения в мейозата да образуват висок процент ембриони с абнормален генетичен код и ниска виталност. При тези случаи с лоша прогноза, PGD технологията дава възможност за селекция на нормалните от генетично абнормалните ембриони и с това чувствително може да подобри възможността за успех.

Преимплантационният генетичен скрининг включва:

• Анеуплоидия на три хромозоми (18, X,Y);
• Анеуплоидия на пет хромозоми (13, 18, 21, X,Y);
• Анеуплоидия на седем хромозоми (13, 17, 18, 21, 22, X,Y);
• Анеуплоидия на девет хромозоми (13, 15, 16, 17, 18, 21,22,X,Y);
• Робертсонова транслокация;
• Реципрочна транслокация;
• Преимплатационна генетична диагностика (PGD) на моногенни заболявания.

Генетични изследвания при мъжа:

• Тестикуларна биопсия, с изследване на мейозата при сперматогенезата;
• FISH анализ на сперматозоидите в семенната течност;
• ДНК фрагментационен тест;
• Y- микроделеции (обхваща 20 типа микроделеции AZFa, AZFb, AZFc и SRY);
• CVBA тест (обхваща 30 мутации на CFTR + полиморфизъм при IVS8-TN гена).